附件1：课程教学大纲模板

《形态学实验技术》

教学大纲

（供医学实验技术专业使用）

锦州医科大学·教务处

二○一六年六月

《形态学实验技术》教学大纲

适用专业：医学实验技术专业等

总学时：12学时理论,16学时实验，总共28学时         

一、课程的性质和任务

    《形态学实验技术》是一门医学专业基础课程。医学实验技术专业学生培养的重要环节是实验操作能力的训练。本课程主要讲授常规组织学切片制备及染色技术、免疫组织化学技术、电子显微镜技术、图像分析技术等。

教学的基本要求和目的注重实验操作能力的训练，从最基本的实验准备开始到实验结果的分析，使学生学会使用形态学实验常用仪器、熟悉科研常用的技术方法，培养学生动手能力、提高学生利用所学知识解决实验问题的能力。

形态学实验技术实验课内容为验证性实验。

结合本科生的培养目标，我们致力于加强教学过程管理，强化学生素质教育，提高教学质量，深化考核方式和方法的改革，调动学生学习的积极性，加强学生平时学习的主动性，让学生重视课程的全过程学习，减轻学生期末考试的压力，降低学生学业负担，提高学习效果。    

二、相关课程的衔接

形态学实验技术包括组织学、免疫组织化学、原位核酸分子杂交、图像分析、组织芯片技术等，涉及组织学、病理学、检验学、细胞学、生物学等多门学科的实验技术，它们是重要的医学基础课程，也是生命科学的基础学科。组织学的研究极大地促进了病理学的发展；生物化学的进步也促进了组织学的发展，例如，将生物化学与分子生物学的原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学，将免疫学的原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织的化学组成、分子结构及其基本生命现象。通过该课程的学习，使学生学会使用形态学实验常用仪器、熟悉科研常用的技术方法，培养学生动手能力、提高学生利用所学知识解决实验问题的能力，启迪学生的科研思维，以适应目前创新型人才的培养要求。

三、教学的基本要求

（一）基本理论知识和技能

1. 熟悉组织学切片制作技术。

2．掌握免疫组织化学常用技术。

3．了解原位核酸分子杂交、图像分析、组织芯片技术。

（二） 基本素质                                    

1．态度   培养学生热爱党、热爱社会主义，立志献身于医学事业；树立良好的职业道德，全心全新意为人民服务；培养严谨的，实事求是的科学作风。
    2．能力   在教学中对学生进行综合能力的培养，即形象思维能力、空间想象能力、自学能力、综合分析能力和描述表达能力等。教师必须研究本大纲所规定的教学内容，掌握好重点和难点。在教学过程中，要注意培养学生严肃的科学态度、严格的科学作风和严密的科学方法；要培养学生独立分析问题与解决问题的能力，提高学生科学思维能力；通过多媒体教学及实验技能操作，理论联系实际，培养学生动手能力。

四、学时分配（理论）

表1 理论学时分配

五、成绩考核

   （一）考核形式及分值权重

形态学实验技术课程考核成绩分为五个部分，包括：出勤记录（5%）、随堂测验（5%）、实验成绩（10%）、阶段成绩（20%）、终结成绩（60%）。课程考核总成绩不及格或终结性考核不及格（按百分制计算60及格），按该门课程不及格认定。

表2 形态学实验技术课程考核成绩分值与权重

（二）考核内容及要求

1、出勤成绩（100分）：考核学生平时上课出勤等，每次课记录在案，期末汇总。

表3  平时成绩评分标准

2、随堂测验（100分）：

（1）考试时间：随堂测验。

（2）考核内容：测验当天及上次课所讲内容。

（3）考核形式：开卷考试。总计12道题，100分。

     ①单项选择题50分：10道题，每题5分。

     ②名词解释50分：5道题，每题10分。

3、实验成绩（100分）：考核内容为撰写3篇实验报告，考核学生撰写实验报告的能力。每篇报告满分100分。当堂上交作业。

（1）成绩计算方法：

∑（xi）

实验报告部分的最终成绩=     3     ； xi ——每篇实验报告的成绩　　

（2）实验报告内容:

表4  形态学实验技术实验报告内容

（3）实验报告评分标准:

简述题：制作统一答案，按给分点进行打分。

4、阶段成绩（100分）：

（1）考试时间：按学校统一规定时间。

（2）考核内容：期中考试前所学过的内容。

（3）考核形式：闭卷、统一考试。总计14道题，100分。

     ①单项选择题40分：10道题，每题4分。

     ②简答60分：4道题，每题15分。

5、终结成绩（100分）：

（1）考试时间：期末结课后。

（2）考核内容：形态学实验技术所涉及的教学内容。

（3）考核形式：闭卷、统一考试。总计36道题，100分。

     ①单项选择题20分：20道题，每题1分。

     ②名词解释10分：5道题，每题2分。

     ƒ简答题40分：8道题，每题5分。

     ④论述题30分：3道题，每题10分。

六、实验指导用书

1. 教科书

[1] 赵荧，唐军民主编，《形态学实验技术》，北京：北京大学医学出版社,2008.8

2. 参考书

[1] 杜卓民主编，《实用组织学技术》，北京：人民卫生出版社,1992.8

[2] 高英茂主编，《医学形态学实验》，北京：科学出版社, 2007

七、教学内容（理论）

（一）绪论、形态学制片种类、组织学切片制作技术（一）

【教学内容】  

1.引言

（1）介绍组织学实验技术发展简史

（2）学习该门课程的意义

2.形态学制片种类

（1）非切片制作方法

（2）组织切片制作方法

3.组织学石蜡切片制作技术（一）

（1）标本取材

    实验动物的处死方法

    ‚不同组织器官的取材方法

    ƒ取材注意事项

（2）标本固定

    固定的目的、作用、方式

    ‚影响固定作用的因素

    ƒ固定后的标本修整及冲洗

    ④常用固定剂的性质及应用

【教学基本要求】 

1.了解组织学实验技术的发展简史及学习该门课程的意义

2.了解非切片制作和组织切片制作方法

3.掌握组织学石蜡切片制作技术

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：非切片制作方法 组织分离标本 组织活体标本 取材 固定 固定剂  

2.石蜡切片的制作过程？ 

3.取材注意事项

4.固定的目的

5.常用的固定剂种类

6.微波固定的关键点

7.影响固定作用的因素

8.固定剂穿透力的计算公式

9.固定后标本冲洗的目的

难点:1.影响固定的因素有哪些

【教学方法与教学手段】

1.以LBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

（二）组织学切片制作技术（二）

【教学内容】

 1.标本处理过程：

    脱水

    ‚透明

    ƒ浸蜡

    ④包埋

2.石蜡切片

    石蜡切片机与切片刀

    ‚石蜡切片技术

3. 染色与染料

（1）染色与生物染料

（2）染色作用原理

（3）染色方法

（4）媒染剂和促染剂

4.HE染色

（1）苏木精

（2）伊红

（3）石蜡切片HE染色

5.封固

（1）封固的目的

（2）封固剂种类

（3）封固剂的折光率

（4）常规石蜡切片封固方法

【教学基本要求】 

1. 掌握组织学石蜡切片制作技术

2. 掌握HE染色原理及步骤

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：脱水、脱水剂、透明、透明剂、浸蜡、酸性染料、碱性染料、毛细现象、吸附作用、吸收作用、活体染色、金属浸染、亲银性染色、嗜银性染色、媒染剂、促染剂、渐进行染色、退位性染色、分色作用、蓝化作用

2.脱水剂的特性

3.HE染色、封固的注意事项

4.脱水、透明、包埋、染色、封固、分色的目的

5.脱水剂的特性

6.常用的脱水剂、透明剂有哪些？

7.石蜡切片制作的注意事项？

8.石蜡切片的质量保证

9.石蜡切片展片标准

10. 生物学染料的必备条件

11. 媒染剂与促染剂的区别

难点:1.影响HE染色质量的因素有哪些

     2.石蜡包埋的注意事项？

【教学方法与教学手段】

1.以PBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

（三）组织学染色技术

【教学内容】  

1.特殊染色技术

（1）胶原纤维染色

   形态结构与特点

   ‚胶原纤维染色

   ƒ磷钼酸或磷钨酸在染色中的作用

④影响结缔组织三色染色的因素

（2）弹性纤维染色

   形态结构与特点

   ‚弹性纤维染色

（3）网状纤维染色

   形态结构与特点

   ‚网状纤维铵银技术的基本步骤与作用

ƒ常用的铵银方法

④网状纤维铵银方法的基本要求

（4）肥大细胞染色

   形态结构与特点

   ‚肥大细胞染色

   ƒ异染性

（5）胰岛染色

   胰岛细胞形态特点

   ‚胰岛细胞染色

（6）糖原染色

   显示糖原的高碘酸-雪夫反应

   ‚Best卡红染色显示肝糖原

（7）细胞内DNA和RNA染色

   Feulgen反应显示DNA

   ‚甲绿-派若宁染色显示DNA和RNA

（8）肌组织染色

   Heidenhain铁苏木精染色

   ‚Mallory磷钨酸-苏木精染色

（9）神经元尼氏体染色

   焦油紫染色

   ‚甲苯胺蓝染色

ƒ硫堇染色

④Luxol坚牢蓝-焦油紫染色

【教学基本要求】 

1. 掌握特殊染色的目的。

2. 掌握胶原纤维染色的原理、注意事项、影响因素。

3. 掌握糖原染色原理及注意事项。

4. 掌握肥大细胞染色原理及注意事项骤。

5. 掌握尼氏体染色原理及注意事项。

6. 熟悉弹性纤维染色、网状纤维染色、胰岛细胞染色、DNA和RNA染色、肌组织染色原理、步骤、注意事项。

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：

单一特殊染色  复合特殊染色  氧化  调色  异染性  原染性  糖原移位假象

2. 特殊染色的目的

3. 影响结缔组织三色染色的因素

4.PAS反应的原理是什么？

5. 影响银离子还原率的因素

6. schiff试剂的保存

7. Feulgen反应原理

    难点：特殊染色的步骤

【教学方法与教学手段】

1.以LBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

（四）免疫组织化学基本方法（一）

【教学内容】  

1.免疫组织化学相关的基本概念。

（1）抗原

（2）抗体

2.掌握免疫组织化学的基本类型与原理

（1）免疫组织化学直接法

（2）免疫组织化学间接法

（3）非标记抗体法

（4）抗生物素-生物素法

（5）其它方法。

3.掌握免疫组织化学技术的种类。

4.免疫组织化学技术的基本过程

5.免疫组织化学石蜡切片的有关基本技术

（1）用于免疫组织化学的标本取材

（2）用于免疫组织化学的标本固定

    用于免疫组织化学的固定剂

    ‚用于免疫组织化学的固定方式

（3）用于免疫组织化学的标本处理过程

（4）用于免疫组织化学石蜡切片的制作

（5）免疫组织化学染色主要步骤及注意事项

（6）免疫组织化学染色主要步骤及注意事项

【教学基本要求】 

1．掌握免疫组织化学相关的基本概念。

2. 掌握免疫组织化学的基本类型与原理。

3. 掌握免疫组织化学技术的种类。

4. 掌握免疫组织化学技术的基本过程。

5.熟悉免疫组织化学石蜡切片的基本技术

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：免疫组织化学 抗原 抗原决定簇 完全抗原  不完全抗原 单克隆抗体  多克隆抗体  基因工程抗体 抗原修复 PAP复合物  ABC复合物

2.免疫组织化学的优点有哪些？

3.抗原具备的特性?

4.用于标记的酶类应该具备的特点?

5.免疫组织化学直接法原理?

6.免疫组织化学直接法的特点?

7. 酶桥法、ABC法、PAP法、SP法、SABC法、ELPS法基本原理?

8.简述单克隆抗体与多克隆抗体的比较

9.免疫组织化学技术的基本过程

10.免疫组织化学取材注意事项?

11.抗原修复的注意事项？

12.免疫组织化学石蜡切片质量的基本要求?

难点:1 SP法与SABC法的异同点

【教学方法与教学手段】

1.以LBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

（五）免疫组织化学常用技术(二)

【教学内容】  

1.血清封闭排队非特异性着色

2.减少或消除内源性生物素

3.抗体

（1）抗体稀释与稀释液

（2）抗体的储存

（3）特异性的第一抗体

（4）抗体的滴加技术

（5）抗体孵育时间与温度

4.显色

（1）标记酶的显色原理与显色剂的选择

（2）酶显色的条件

（3）显色的操作

5.检测系统

6.免疫组织化学复染

7.孵育盒的作用

8.封固剂的使用

9.免疫组织化学结果与非特异染色的控制

10.常见的免疫组织化学问题

11.双重免疫组织化学染色

（1）双重免疫标记染色种类

（2）常用的双重免疫标记配伍类型

（3）双重免疫组织化学的基本种类

（4）常用的双重免疫组织化学染色方法

（5）消除双重免疫组织化学染色间抗体系统的交叉反应

（6）双重免疫组织化学注意事项

【教学基本要求】 

1. 掌握免疫组织化学的基本过程及注意事项

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：特异性第一抗体 前带效应  复染  水溶性封固剂  无靶抗原对照  空白对照  替代对照  同型对照  阴性对照  阳性对照  背景染色  双重免疫组织化学染色

2.HRP显色反应的原理

3.DAB使用时的注意事项

4.酶组织化学染色时应注意哪些问题以控制酶反应条件

5.免疫组织化学结果的判定与观察

6.免疫组织化学阳性细胞的特征

7.阴性对照的种类

8.如何辨别特异性染色和非特异性染色

9.非特异性染色的消除方法

难点:1.造成全片着色的可能原因

【教学方法与教学手段】

1.以LBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

（六）原位核酸分子杂交【教学内容】  

1.原位核酸分子杂交的基础知识

（1）核酸的化学组成

（2）DNA和RNA

（3）DNA变性与复性

2.原位分子杂交的基本原理

（1）基本原理

（2）探针类型与制备

（3）探针标记物与探针标记方法

3.原位核酸分子杂交技术的基本步骤与原理

（1）杂交前准备

（2）杂交预处理

（3）杂交反应

（4）杂交后处理

（5）杂交体的检测

4.原位杂交对照实验和实验中的问题与对策

（1）对照实验

（2）实验中的问题与对策

5.综合实验项目设计及分析

（1）SP法实验设计及分析

（2）ELPS法实验设计及分析

【教学基本要求】 

1.掌握原位杂交的基本步骤与原理。

2.了解原位杂交对照实验和实验中的问题与对策。

3.掌握SP法与ELPS法实验设计与分析.

【重点与难点】  

重点：1.名词解释：DNA变性  DNA复性  原位杂交  探针  杂交反应  杂交严格度

2.DNA的一级结构、二级结构和三级结构分别指什么？

3.影响DNA复性速度的因素

4.原位杂交探针有哪些

5.杂交预处理的目的是什么

6.杂交后处理的目的是什么

【教学方法与教学手段】

1.以LBL教学方法为主，辅以PBL和启发式教学方法，充分调动学生的学习热情，由浅入深，把上皮组织的微细结构讲解清楚。

2.将图片与动画有机结合，使枯燥的形态学内容丰富起来。

八、实验教学

（一）学时分配

表6 实验学时分配

（二）实验内容

实验一：标本制备与石蜡包埋（4 学时）

【目的与要求】  

1.掌握标本的取材与固定方法。

2.掌握标本的脱水、透明、方法。

【内容提要】 

1.实验用具:温箱,浸蜡烧杯,解剖盘、解剖剪、解剖镊子,酒精灯,包埋模,纯甘油,乙醇,二甲苯,脱蜡容器,火柴,卷纸,刀片,铅笔,量筒,固定瓶，卷纸

2.实验试剂：甲醛溶液、乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）、二甲苯、石蜡液（58-60度）

3.实验动物：小鼠

4.实验内容

（1）配制10%福尔马林固定剂

（2）小鼠断髓操作

（3）小肠、肝、肾标本的取材

（4）标本的固定

（5）标本固定后的再修整

（6）脱水

（7）透明过程

（8）浸蜡与包埋

（9）清洁实验器械、处理实验污物

5.实验操作

（1）配制10%福尔马林固定剂：100ml量筒取10ml甲醛溶液，加蒸馏水到100ml，混合均匀即可。

（2）小鼠断髓操作：左手拇指和示指抓住小鼠尾巴概况。右手拇指和示指经小鼠的背后紧紧按住其耳后部不动。左手向后平拉鼠尾，直到手上有一种拉断的感觉即可。

（3）小肠、肝、肾标本的取材：

①小鼠腹部表皮用自来水浸湿，仰卧于解剖盘上。

②用解剖剪和镊子将小鼠腹部毛皮和肌肉依次打开，尽量将取材视野扩展开一些。

③小肠标本取材：将肝向上翻起，暴露胃与小肠，小镊子夹住胃与小肠连接部，小解剖剪从胃与小肠连接部剪断，向上轻轻提起小肠断端并拉出肠管，截取一段小肠肠管放置于纸上，梳理肠管，直接放入10%福尔马林固定剂。

④肝标本取材：小解剖镊子夹住肝边缘并向外轻轻拉出，用小解剖剪尽量一次剪下肝组织，放在纸上。用刀片切云镊子夹过的组织，然后将标本切成长方体，注意标本要带有被膜，用镊子托起标本投入到固定剂内。

⑤肾标本取材：小解剖镊子将肠管拉向一侧，暴露出腹后部的肾。小镊子夹住肾门处的结缔组织并轻轻向上提起，小解剖剪从肾下面剪断结缔组织，将肾放在纸上，用刀片将其两端的组织切云，保留肾中间部分，注意小鼠肾只有一个肾乳头，因此标本应保留得多一些，同时还应注意坚信被膜的保存，用镊子轻轻拖起标本投入到固定剂中进行固定。

⑥取材后，清洗解剖器械，处理实验污物。

（4）标本的固定：于10%福尔马林固定剂内固定一段时间（根据组织块的大小来调整固定时间）。

（5）标本固定后的再修整：固定一段时间的标本，对其进行适当的修整。将标本修整为大小适宜的长方形、正方形或梯形体，同时也要做出标本包埋的切面，切忌将标本切面修整成三角形或圆形。此步骤十分重要不可省略。

（6）脱水过程：将固定瓶中的固定液倾出，倒入少量的70%乙醇，涮洗标本后将乙醇倒掉，重新加入70%乙醇，标本与乙醇的体积比为1:(15～30)。常规大小的标本（1cm×1cm×0.3cm）。70%乙醇脱水3小时～数天。80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇的脱水方法与70%乙醇相同，各级乙醇的脱水时间为3小时～数天。标本在100%乙醇的脱水时间为1.5～3小时，期间更换一次新的100%乙醇。（因时间原因，此步骤仅对学生演示操作步骤，并不按照实际的脱水时间执行）。

（7）透明:将固定瓶中的100%乙醇倒出后，加入少量的二甲苯，涮洗标本后倒掉，重新倒入二甲苯，注意标本与二甲苯的比例量为1:(15～30)。标本透明时间为5-30分钟，中间更换一次新的二甲苯（注意：透明期间仔细观察标本在脱水状态和透明状态的差异）。

（8）浸蜡与包埋

①浸蜡：将蜡箱内已过滤的石蜡液倒入干净的浸蜡容器中备用。用镊子轻轻夹出透明好的标本块，放在滤纸上吸云组织表面多余的二甲苯后，投入浸蜡容器内进行浸蜡。浸蜡时间为1.5～2小时，中间应更换一次新蜡液（因时间原因，此步骤仅对学生演示操作步骤，并不按照实际的浸蜡时间执行）。

②包埋：将包埋模提前放入温箱内预热，包埋前倒入石蜡，将标本放入其中，尽量放在中间位置。注意标本切面向下（标本切面与包埋器的底部接触）。关上温箱门，约5～10分钟后，将包埋模轻轻取出，放置冷台上促其冷凝（包埋过程中要求操作者的运作要迅速、准确，同时解剖镊子要经常在酒精灯火焰上加热，防止石蜡凝固在镊子尖表面）。

（9）清洁实验器械、处理实验污物。

实验二：石蜡切片、HE染色及特殊染色(焦油紫染色)（ 4 学时）

【目的与要求】  

1.掌握石蜡切片的要领及注意事项。

2.掌握HE染色方法。

3.掌握焦油紫染色方法。

【内容提要】 

1.实验用具:石蜡切片机,酒精灯,小镊子,毛笔,火柴,载玻片,玻璃平皿,显微镜，HE染色缸一套，焦油紫染色缺一套，树胶瓶，吸水纸，盖玻片，

2.实验试剂:梯度乙醇,二甲苯,苏木精染色液,伊红染色液, 蛋白甘油,0.5%焦油紫染色液

3.实验材料：石蜡块若干、大脑切片若干张

4.实验内容: 

（1）石蜡切片操作

（2）展片操作

（3）烤片

（4）HE染色

（5）焦油紫染色

5.实验操作

（1）石蜡切片操作

①先上蜡块:标本蜡块固定于切片机标本台上,粗略调整标本切面的方向,使其与切片刀平行。

②再上切片刀：将一次性切片刀置于一次性刀架上。

③调节切片厚度：常规石蜡切片为5-7微米。

④调节切片刀与标本切面间的距离。

⑤左手手持毛笔，右手转动切片机手轮进行切片。

⑥左手持毛笔拖住蜡笔，并轻轻转动毛笔向外抻拉，也可以用小弯镊子夹信蜡带，轻轻向外抻拉。

⑦右手持刀，左手毛笔，左手持毛笔经蜡带下方向上轻轻扫取刀刃上的蜡带，并将其轻轻放在切片板上。也可以右手持毛笔从弯钩镊子夹住的蜡带下方向上轻轻扫取刀刃上的蜡带，再将基放在切片板上。

（2）展片操作

①取少量蛋白甘油，均匀地涂抹在载玻片表面，置于切片架上待用。

②蜡片切成后，用刀片切取3-4张石蜡切片，切面朝下把切片放入50℃水中,摊平后用镊子轻轻将连续蜡片分开,再用载玻片捞起,蜡片应捞在玻片的1/3处。

③若组织上有皱褶，可以借助镊子，当加热后的石蜡切片缓慢向外舒展时，用镊子弯面轻轻撑开蜡片。

注意：抻拉的力量不能过大，避免组织破碎。

④展片标准：组织变白，其周围石蜡近似透明，组织上无皱褶、撕裂和气泡

⑤实验要求：每张载玻片上摆放2～3张石蜡切片，每种标本制备两种载玻片。

（3）烤片：将展平的组织切片分别裱在不同的载玻片上，控净载玻片上的水分，调整好组织切片的位置，即切片位于整个载玻片的三分之二处，置于烤片机上进行烤片。常规烤片时间大于6小时或过夜。

（4）HE染色

①二甲苯，5分钟×2次；

②100%乙醇，4分钟×2次；95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，每级4分钟。蒸馏水，3分钟；

③苏木精染色液，10分钟。自来水冲洗1分钟。蒸馏水浸泡1分钟；

④0.5%盐酸乙醇分化：数秒～数十秒。流水冲洗20分钟，光镜下镜检细胞核分色程度。注意此步骤可重复多次；

⑤1%伊红染色液，1分钟；

⑥80%乙醇、90%乙醇速洗；

⑦95%乙醇30秒～1分钟，可于此步在光镜下镜检红蓝颜色对比程度；

⑧100%乙醇，4分钟×2次；

⑨二甲苯，5分钟×2次；

⑩切片封固：从二甲苯缸中取出透明好的组织切片，组织面向上放在白纸上，用吸水纸吸掉组织左右两边多余的二甲苯，滴加适量的树胶，用小解剖镊子夹住盖玻片一边，缓缓盖在切片的组织上，摆正盖玻片的位置即可。

染色结果观察：细胞核为蓝紫色（苏木精染色）；细胞质、肌肉、胶原纤维、嗜酸性颗粒等 为粉红色或红色（伊红染色）。

（5）焦油紫染色

①取大脑切片，石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。步骤同HE染色①～②；

②0.5%焦油紫染色液，10～20分钟；

③蒸馏水洗。光镜下镜检。用吸水纸将组织周围的水分洗吸干；

④100%乙醇快速脱水，2次，每次2～3分钟；

⑤二甲苯透明，2次，每次3～5分钟。树胶封固。

染色结果观察：尼氏体、神经细胞核为蓝紫色，组织背景无色或浅蓝色。

实验三：免疫组化实验（ 8学时）

【目的与要求】

1. 掌握免疫组化SP法染色的原理及步骤。

【内容提要】

1.实验用具：酒精灯,小镊子,火柴,载玻片，显微镜，HE染色缸一套，树胶瓶，吸水纸，盖玻片，石蜡切片若干张，卷纸，微量加样器（大、小），各种规格枪头若干，染色架，EP管若干，铅笔，高压锅，免疫组化笔，旋涡混合仪，水浴箱，湿盒

2.实验试剂：一抗，SP试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，双蒸水，过氧化氢，苏木精染色液，梯度乙醇，二甲苯，中性树胶

3.实验材料：石蜡切片若干张

4.实验内容：

（1）免疫组织化学染色

（2）整理实验用具，处理实验污物，清洁实验室

5.实验操作

（1）染色步骤：

①石蜡切片常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ10min→无水乙醇Ⅱ10min→95%乙醇Ⅰ4min→95%乙醇Ⅱ4min→90%乙醇4min→80%乙醇4min→双蒸水洗4min→0.01M PBS漂洗4min）；

②灭活内源性过氧化物酶：3% 过氧化氢溶液处理10～30min以去除内源性过氧化物酶，0.01M PBS洗涤3 次，每次 5min； 

③高压修复抗原：将切片置于含PH 6.0 枸椽酸缓冲液的高压锅内，加热至减压阀喷气2min，自然冷却，取出，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5min；

④滴加5%BSA封闭液，室温10～30min以去除非特异性反应。甩去多余液体，不洗；

⑤滴加适当浓度稀释的一抗（兔抗大鼠单克隆抗体*****），4 ℃孵育过夜，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5min；

⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育 30min，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5min；

⑦滴加试剂SP，37 ℃孵育 30min，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5min；

⑧DAB显色，光镜下控制细胞显色程度，5～20分钟；自来水冲洗3～5分钟；

⑨苏木素复染5分钟，自来水冲洗1分钟。蒸馏水浸泡1分钟；0.5%盐酸乙醇分化：数秒～数十秒。流水冲洗5分钟；

⑩脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

（2）染色结果观察：阳性表达细胞为黄色或棕黄色颗粒，组织背景无色。

（3）整理实验用具，处理实验污物，清洁实验室

（三）成绩考核

详见：五、考核方案

   （四）指导用书

1. 教科书

[1] 赵荧，唐军民主编，《形态学实验技术》，北京：北京大学医学出版社,2008.8

2. 参考书

[1] 杜卓民主编，《实用组织学技术》，北京：人民卫生出版社,1992.8

[2] 高英茂主编，《医学形态学实验》，北京：科学出版社, 2007

 九、其它

（一）形态学实验技术主讲教师职责

显微形态学实验教学平台负责形态学实验技术课程考核方案的制定、考核过程的监督，协同平台主讲教师对学生的进行考核方案的实施，组织协助主讲教师对学生上课情况进行评估考核，对学生课程考核资料（实验报告等）进行归类存档等。      

主讲教师在形态学实验教学的考核中，主要负责该课程考核方案的实施，考核结果的汇总与记录等。

1、依据教学大纲安排授课内容及进度。

2、第一次课对学生公布课程考核方案，使全体学生知情课程考核相关要求、考核时间、考核方式、考核内容、评分标准。

3、平台要依据教学大纲要求及讲授内容，制定考核实施办法及步骤。协助主讲教师根据考核计划安排对学生进行考核。

4、按权重将各部分考核成绩汇总，计算出课程最后总成绩。

5、每学期末，教研室要组织本课程所有任课教师，对考核改革方案的科学性、执行情况和教学效果进行系统评价，并形成评价分析报告和整改意见上报学院教务处。

（二）成绩记载与管理

本课程的综合成绩按以下方法记载：

1、考核分五部分：出勤记录、随堂测验、实验成绩、阶段成绩、终结成绩考试，每项考核成绩均按百分制记载。

具体计算方法为：X =出勤记录×0.05+随堂测验×0.05＋实验成绩×0.1＋阶段成绩×0.2＋期末考试成绩×0.6

  2、考核均由主讲教师组织、实施、评定，要客观、公正、准确。成绩一经评定，不得随意改动。

3、期末考试成绩低于36分，或者考核总成绩低于60分者，按该门课程不及格认定。根据学校统一规定，如符合补考条件，可给予一次补考机会，且只补考终结理论部分（成绩后标注“补”字样 ）；补考后仍不及格者，按学校相关规定处理。

4、无故缺勤（即缺勤未出示请假条）3次以上者（含3次），不允许参加期末考试，本门课程计为0分，且不给补考机会，需和下一年级重修。

执笔人：包翠芬   教研室：显微形态平台  二级学院教学副院长审核签名：